Spherisorb色譜柱的安裝、平衡和初始柱效測試
Spherisorb分析柱耐用、柱效高，出現在數千篇色譜參考文獻中。色譜柱長度和直徑范圍廣，在優化方法和減少溶劑消耗方面為您提供了極大的靈活性。按照本手冊中的指導，從您的分析色譜柱和保護柱中獲得最佳性能、再現性和耐用性。
每根Spherisorb色譜柱都附帶一份性能測試色譜圖。此性能測試色譜圖會提供每根色譜柱的以下信息：凝膠批號、色譜柱序列號、USP理論塔板數、USP拖尾因子、容量因子以及色譜條件。請妥善保存性能測試色譜圖，以備將來參考。
A.色譜柱安裝
注：下述步驟給出的流速適用于典型的4.6 mm內徑色譜柱。可根據所安裝Spherisorb色譜柱的柱內徑、柱長、粒徑和柱壓相應地提高或降低流速。色譜柱內徑和/或柱長改變時，請參閱“放大/縮小等度分離方法"部分計算流速。有關連接HPLC的詳細信息，請參閱“將色譜柱連接到HPLC系統"。
1、反相色譜柱
1）灌注泵系統，排出含緩沖液的流動相，然后將色譜柱的入口端連接至進樣器出口。
2）用100%有機流動相(甲醇或乙腈)沖洗色譜柱，泵流速設置為0.1 mL/min，并在5 min內增加至1 mL/min。
3）當流動相可從色譜柱出口自由流出時，停止液流并將色譜柱出口連接至檢測器。這能防止空氣進入檢測系統，使系統更快達到基線平衡。
4）按照步驟2所述逐漸增加流速。
5）一旦柱壓和基線達到穩定狀態，即可繼續進行下一部分操作。
2、正相色譜柱
注：以下操作假定您的系統運行過反相色譜分析。如果并非如此，您可以從第3步開始。
1）灌注泵系統，排出任何含有緩沖液的流動相。
2）用乙腈徹底沖洗系統。
3）將系統的流動相換成您計劃在正相色譜中使用的流動相。
4）連接色譜柱并用流動相平衡色譜柱。
注：用流動相平衡色譜柱時消耗的溶劑量可能比反相色譜更多。
B.色譜柱平衡
Spherisorb色譜柱是在測試用流動相中保存的。在更換為其他流動相體系之前，務必確保流動相的兼容性。請用至少10倍柱體積的流動相平衡色譜柱(請參閱表2中的空色譜柱體積)。
1、反相色譜柱
為了避免流動相緩沖液在色譜柱或系統中發生沉淀，請使用5倍柱體積的水/有機溶劑混合物沖洗色譜柱，其中有機溶劑比例應與所需緩沖鹽流動相中的有機溶劑比例相同或更低。(例如，使用60%甲醇水溶液沖洗色譜柱和HPLC系統，然后再引入60%甲醇/40%緩沖液組成的流動相)。
注：如果流動相中的添加劑濃度較低(例如離子對試劑)，那么完成平衡可能需要100-200倍柱體積的流動相。
2、正相色譜柱
(Spherisorb硅膠色譜柱、氨基柱、氰基柱)
Spherisorb正相(NP)色譜柱出廠時用96%庚烷/4%異丙醇保存。請謹慎操作，避免讓任何可能導致沉淀的流動相通過色譜柱(見上文)。Spherisorb正相(NP)色譜柱與水和所有常用的有機溶劑兼容，前提是考慮溶劑的混溶性。
用流動相平衡正相硅膠色譜柱。即使流動相中只含非常少量的水，也會顯著影響正相填料的活性。為獲得良好的重現性，請確保流動相的水含量始終相同。
流動相中的水很難徹底去除，且通常也沒必要這樣做。使用無水流動相可能要花很長時間才能使色譜柱達到平衡。對于大多數應用，推薦采用的含水量為飽和值的50%。
要平衡色譜柱：
1）從0.0 mL/min開始，以0.1 mL/min的增量使流速增加到1.0mL/min。
2）用流動相平衡色譜柱，直至基線穩定。
3）比較2-3次連續的重復進樣，驗證標準品的保留時間和峰面積是否穩定。
使用新色譜柱運行首次分析之前，請先執行柱效測試以確認色譜柱的性能。
C.初始柱效測定
1. 使用色譜柱之前，需要先進行一次柱效測試。沃特世建議您在收到色譜柱后使用“性能測試色譜圖"中所述的溶質混合物對色譜柱進行測試。但是，如果色譜柱只用于單次常規等度分析，那么在等度條件下測試色譜柱可能更方便。請記錄初始色譜柱性能。
2. 測定理論塔板數(N)，并定期對比該數值。
3. 按預定的時間間隔進行重復測試，跟蹤色譜柱性能隨時間的變化情況。采用兩套不同的HPLC系統進行測試時，所得柱效結果可能會有微小差異，這可能是由于連接質量、運行環境、系統電子設備、試劑質量、色譜柱條件和操作員技術等因素所致。
